荧光原位杂交(FISH)探针的制备

日期:2019-11-12 15:08
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摘要: 实验原理 染色体荧光原位杂交始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合,这种结合开创了一门新的学科——分子细胞遗传学。其基础是Southern blot原理,以半抗原如生物素、地高辛间接标记或以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针,探针和靶序列双链DNA变性后杂交,互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA,通过荧光标记的亲和素或抗地高辛抗体将半抗原显示出来,通过荧光显微镜观察杂交信号,然后在FISH分析软件(http://www.widlc.com/naturegen...


实验原理


 

染色体荧光原位杂交始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合,这种结合开创了一门新的学科——分子细胞遗传学。其基础是Southern blot原理,以半抗原如生物素、地高辛间接标记或以荧光素直接标记的已知核酸分子为探针,探针和靶序列双链DNA变性后杂交,互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA,通过荧光标记的亲和素或抗地高辛抗体将半抗原显示出来,通过荧光显微镜观察杂交信号,然后在FISH分析软件(http://www.widlc.com/naturegene_Product_17737660.html)中进行定量分析。FISH具有快速灵敏、特异性好的特点,可同时分析分裂期和间期的多个细胞,并进行定量;可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型;还可以使用多种荧光标记,显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向,空间定位**。


 实验步骤

 


**天

缺口平移标记探针

1. 试剂准备

1) 0.1mmol/L dNTP

 0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等体积混合。

2) 0.1mmol/L dTTP

1倍体积的0.3mmol/L dTTP和2倍体积的三蒸水混合。

2. 缺口平移体系和反应条件

0.1mmol/L dTTP 6.5μl

0。1mmol/L dNTP 10μl

10× Nick Translation buffer 5μl

1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl

Nick Translation Enzyme 10μl

DNA (1μg) X μl

H2O 18-X μl

in total 50μl

以上为标记1μg DNA的缺口平移体系,若标记更多量的DNA,则试剂量和反应体系相应等倍扩大。各成分混匀后短时离心。对于≤10kb的质粒,于15℃反应3.5小时;对于BAC/PAC,于15℃反应9小时。

3. 凝胶电泳判断探针大小

将EP管置于冰上,取其中5μl 于70℃加热5分钟后行2 %琼脂糖凝胶电泳以观察所标记探针的大小,单一序列探针合适大小为200~600bp;如片段大小偏大,则于15℃延长反应10~30分钟,再重复进行凝胶电泳,直至得到合适大小的探针。

4. 终止反应

向反应体系中加入1μl 0。5M EDTA和(或)70℃加热5分钟,以灭活酶。探针于-20℃保存备用。


第二天

1. 探针的沉淀和变性

1) 探针混合物的组成

a. 对BAC/PAC探针

DNA探针 5ul

Human Cot-1 DNA 3ul

Salmon Sperm DNA 0.5ul

H2O 1.5ul

in total 10ul

b。 对着丝粒探针:

DNA探针 5ul

Salmon Sperm DNA 0.5ul

H2O 4.5ul

in total 10ul

2) DNA的沉淀

将探针混合物与1ul(V/10)3M醋酸钠(PH5。2)和27。5ul(2。5V)无水乙醇(-20℃冻存)混合,-80℃沉淀30min(或-20℃沉淀过夜),以14000g在4℃离心30min,以沉淀DNA。

3) 清洗沉淀

小心弃去上清,用70 %乙醇洗涤一次,再次以14000g在4℃离心15min;小心弃去上清,在45~50℃的中温水浴中风干DNA沉淀10~15min。

注:当大部分乙醇蒸发时,白色的DNA沉淀变为半透明状;一定要彻底**乙醇,否则会在加入Master Mix后产生微小的沉淀,导致高背景。

4) 溶解探针

加入5μl 预热至37℃的去离子甲酰胺(PH 7.0),短时离心后在37℃振摇30min以充分溶解DNA;再加入预热至37℃的Master Mix 5μl,短时离心后在37℃振摇15~30min。

注:振摇时间尽可能延长;DNA沉淀亦可以TE缓冲液1.1μl溶解后加入Vysis探针缓冲液4.4μl稀释,混匀后瞬时离心,37℃振摇15~30min。

5) 探针的变性和预杂交

短时离心后于80℃水浴中变性探针10min,冰浴5分钟;短时离心,于37℃水浴中预杂交30~60min;独特序列探针(如cDNA)和重复序列探针(如α-卫星DNA)探针,无需预杂交。

2. 标本(染色体靶DNA)的处理和变性

1) 滴片和老化

取出储存于-20℃的细胞悬液标本,以1100 rpm.离心10min沉淀细胞,换用适量体积的新鲜甲醇:冰乙醇(v/v)=3:1固定液重悬细胞并调整细胞密度,滴片,划出杂交区域,晾干;在预热到 37℃的2×SSC中老化30min(也可实验前夜室温过夜老化再以2×SSC浸泡2分钟);依次于70 %、90 %和100 %的梯度乙醇中依次脱水,每缸2min,晾干(以下略作“梯度乙醇脱水后凉干”)。

2) RNase A消化

每张玻片上加30μl 100μg/ml RNA酶(将10mg/ml的RNase A储存液稀释100倍),盖上22×22mm盖玻片,置于37℃湿盒中孵育1小时;室温下2×SSC中振荡洗涤,5min/次×3次;梯度乙醇脱水后凉干。

3) 靶DNA的变性

将玻片放入预温至72℃(每增加一张玻片,温度要提高1℃)的70 %去离子甲酰胺/2×SSC中变性2分钟后,立即置入预冷至-20℃保存的梯度乙醇脱水晾干。

4) 蛋白酶消化

将50μl 100 mg/ml的胃蛋白酶(终浓度为0.01 %)加入预温至37℃的50ml蒸馏水(PH 2.0,以适量稀盐酸酸化)中,混匀;将变性后的玻片放入其中处理10分钟;室温下1×PBS中振荡洗涤,5min/次×2次;室温下梯度乙醇脱水后凉干。

注:靶DNA的变性和消化应与探针变性同步进行,完成后尽快进行杂交。

3. 杂交

将变性后的DNA探针加于玻片杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,封片后置于湿盒中,37℃杂交过夜。


第三天

1. 杂交后洗涤和半抗原信号放大

1) 杂交后洗片

小心揭去封片胶和盖玻片,将玻片置于预热至46℃的50 %甲酰胺/2×SSC中,5min×3缸;将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸;每张玻片滴加30 μl阻断液1,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;再次将玻片移入室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。

注:此后步骤应注意避光操作。

2) 滴加一抗

将4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育1小时;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。

3) 滴加二抗

将4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat anti-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育40min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。

4) 滴加三抗

将4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀释于100 μl 抗体稀释液1中,混匀;每张玻片滴加25 μl 于杂交区域,盖上22mm×22mm盖玻片,于37℃湿盒中孵育30min;室温下4×SSC/0.1 % Tween-20中振荡洗涤5min×2缸。

注:以上步骤按双色FISH描述,若为单色FISH则选择相应抗体即可。

2. 核复染和抗荧光淬灭剂封片

将1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中(终浓度为125 ng/ml,避光保存于4℃),混匀;将玻片置于其中,避光复染2min;2×SSC中洗涤5min;梯度乙醇脱水晾干;每张玻片滴加10 μl 抗荧光淬灭剂封片,盖上22mm×22mm盖玻片,-20℃避光保存。

3。 荧光显微镜检测FISH杂交信号

以荧光显微镜观察,在DAPI/FITC/Texas Red滤光镜激发下观察中期/间期细胞的荧光杂交信号,在FISH分析软件(http://www.widlc.com/naturegene_Product_17737660.html)中计数细胞和采集图像。每例分析100~200个间期细胞核细胞,重叠、破损、未去除细胞质和杂交信号微弱的细胞核不计入其中。对于双色双融合FISH,细胞内杂交信号相互靠近(<1/10核直径的距离)者计为一个信号。

4。 储存数据



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